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   在21世纪之初，成本的急速下降和技术的飞速发展促使许多科学家争先恐后地对DNA进行测序。基因组学领域蓬勃发展，众多类型的生物完整的基因组序列都被公布于众。虽然现在基因组测序已成为日常性的工作，但由此产生的大量DNA数据并不足以完全解释生物学家研究的许多现象。

   一个同样的基因组是如何产生复杂生物体中的所有细胞的？癌细胞通过开关哪些基因来逃避在其生长过程中的正常检查？淋巴细胞如何对病原体作出反应，以及病原体如何逃避这种反应？要回答这些问题，需要通过测序和跟踪基因组产生的RNA转录本的变化从而更深入地研究细胞信息流。

   但RNA比DNA更难研究：它很容易降解，必须逆转录来对接大多数测序技术。不同基因的转录本也有着巨大的差异。幸运的是，研究人员和实验器材试剂供应商一直在稳步改进RNA测序工具，为迅速发展的转录组学领域提供动力。随着技术的进步，科研人员们越来越多地研究单个细胞内的RNA变化，在全新水平上观测了细胞行为。

 

原位的真实

 

   RNA测序的历史是一个关于稳步提高的分辨率的故事。十年前，大多数转录组学研究人员从细胞群体中批量分离RNA，然后使用逆转录酶和标准DNA测序技术来揭示每个群体的平均转录组。今天，这一领域已经在很大程度上转向单细胞RNA测序，使用各种技术来分离和标记单个细胞，然后为每个细胞生成单独的转录组图谱。利用这种方法，研究者已经发现基因表达在细胞间存在显著差异，而这些群体在之前还被认为是具有同质性的。

   2014年，位于哈佛大学的维斯研究所的研究人员更进一步，对细胞中的RNA进行了原位测序，以准确显示哪些细胞在完整的组织切片和培养板中转录了哪些基因。这项技术需要将细胞的RNA固定在适当的位置，然后直接在固定的样本上执行逆转录、扩增和测序步骤。由于测序过程使用了四个碱基的荧光标记，研究人员可以在荧光显微镜下拍摄每一步，用计算机处理图像，并绘制出每个细胞中出现的RNA序列。

    “它做的是市面上很多新一代测序仪做的事情；但它不是在流体腔里做，而是在样品自身内部做”。 维斯研究所合成生物学平台的首席高级研究员Richie Kohman说。

   Kohman和他的同事们现在正在众多项目中使用这项名为“荧光原位测序”(FISSEQ)的技术。在一项工作中，研究小组使用基因工程病毒为单个小鼠神经元分配独特的标签，然后执行FISSEQ来检测病毒RNA并绘制动物神经元连接的图谱。另一个项目使用基因编辑载体来产生细胞RNA标签，随着老鼠从胚胎发育到成年，这种标签会随着时间的推移而变化。在这些小鼠身上进行FISSEQ应该可以让研究人员追踪每一个细胞在发育过程中的联系。

    “尽管FISSEQ比在分离的细胞中测序RNA明显产生更深层次的数据，但FISSEQ更难掌握。你必须将RNA转换成DNA，然后你必须让DNA形成一个环，然后你才能进行扩增；所以做这件事所需的所有化学过程需要大量的工作”。Kohman说。他还补充道：“实际的测序有其本身的一系列挑战，但由于高通量测序技术的发展，这也对解决问题有一定程度的助益。”

   FISSEQ需要标准的荧光显微镜设备和在显微镜载物台上控制流过样品的复杂系统。流体控制系统在商业上是可以买到的，但对于不是专门研究显微镜的实验室来说，它们的价格可能太高了。FISSEQ产生的庞大数据集也需要复杂的生物信息学工具来分析。为了解决这些需求，维斯研究所的团队成立了ReadCoor公司，该公司计划向研究人员提供FISSEQ产品和服务。

 

微小的空泡

 

   许多研究人员不需要原位技术提供的空间细节，特别是在免疫学等细胞天然就自由漂浮的领域。对于这些科学家来说，多家供应商提供的系统使单细胞RNA测序变得非常容易。在这些公司竞争的同时，他们也在不断改进自己的产品。

   例如，位于加州普莱森顿的10X Genomics公司是用户友好型单细胞RNA测序技术的先驱之一。要使用该公司的系统，研究人员只需将悬浮细胞的样本加载到一个专门的微流控芯片上。微流控装置将样本分离成数千个微小的液滴，每个液滴包含一个细胞和一个凝胶珠。这些珠子带有独特的寡核苷酸条形码。然后，这些液滴经过标准的逆转录和测序，产生一个数据集，在这个数据集中，每个细胞的完整转录组都与其各自的条形码相连。该系统附带的软件可以让研究人员浏览和可视化数据，或者他们也可以将数据导出，用自己的算法进行处理。

   最初的10X系统侧重于单细胞RNA测序，但新版本增加了同步DNA测序和染色质分析。10X公司首席科学官兼联合创始人Ben Hindson说：“我们增加了这一功能来观察蛋白质的表达，我们可以对抗体或其他可能与细胞相互作用的蛋白质进行条形码编码，并在观察基因表达的同时将其读出，可能还包括它们特定的DNA克隆类型。” 

   在该系统当前的技术水平上，在一个给定的实验中，研究者可以同时观察特定细胞的两个特征，例如，跟踪淋巴细胞表面蛋白质的表达和同一细胞的RNA转录组。Hindson预计，未来的系统将允许更多的同步分析，从每个细胞中提取更多数据。他说：“当我们展望这一领域的未来时，从一次运行中获得尽可能更多的信息顺理成章。”

   微流控系统的速度使研究人员能够研究大量的单细胞。每个芯片有八个通道，每个通道可以容纳1万个单元，每次运行的潜在通量为8万个细胞。的确，该公司已经展示了在短短几天内分离、条形码编码和测序100多万个细胞的完整转录本的能力。

   然而，雄心勃勃的计划着复制这种巨大成就的研究人员们，应该准备好迎接一些来自价格方面的冲击波。Hindson解释说，虽然10X系统本身的定价符合学术资本预算和拨款建议，但每个细胞中每个RNA分子的测序成本随着实验规模的扩大而迅速上升。

   幸运的是，一旦细胞被分离并进行条形码编码，研究人员就可以决定他们的实验所需的测序水平。只想将细胞分类为特定类别的免疫学家，可能只需要对更多细胞较少的测序读数；而致力于新发现的分子生物学家可能会需要在更少的细胞上获取更多的测序读数。

 

几率的游戏

 

   其他制造商也提供单细胞测序工具，每家公司都有自己的细胞分选和条形码编码策略。专家建议刚刚开始进行RNA测序的科研人员仔细比较这些选项，因为它们有不同的优点和局限性。

   实验仪器和试剂巨头BD Biosciences使用一种简单但稳定的细胞条形码编码方法，该方法基于一种称为泊松分布的统计现象。在该公司的Rhapsody细胞索引系统中，实验人员将每个样本稀释至包含约2万个自由漂浮细胞，然后将样本装载到一个包含20万个微孔的特殊设计的盒子中。在每孔只稀释0.1个细胞的情况下，泊松分布意味着含有细胞的孔有可能只有一个单细胞。然后，研究人员将标记了寡核苷酸的珠子装载到盒子中，每个珠子都带有一个独特的条形码，条形码上有一个多聚腺苷化标签，可以与mRNA结合。

   新泽西州富兰克林湖BD公司的应用市场高级总监Stephen Kulisch解释说，这些孔的设计使得它们实际上只能容纳一个细胞和一个珠子，所以任何多余的珠子都可以通过简单的洗涤从盒子中洗掉。一个可选配的成像系统允许调查人员检查这一过程的效率。Kulisch说：“你可以对这个阵列进行成像，得到关于多方位的一些非常好的统计数据，以及你捕获了多少个细胞，你有多少个珠子与细胞的组合。”

   一旦单个细胞与条形码珠子完成配对，该系统遵循与其他RNA测序方法相同的一般路径—裂解细胞，逆转录RNA，然后对得到的DNA进行测序。因为DNA分子绑定了与它们共用一孔的多腺苷条形码，所以该系统的软件可以将每个序列追溯到产生它的细胞。

   像10X一样，BD也在努力从每个细胞中提取更多的数据。该公司现在提供了一系列用自己的分子条形码标记的抗体。通过再将装入Rhapsody试剂盒之前的细胞，与这些抗体孵育，科研人员可以从同一细胞中获得完整的转录组序列和蛋白质表达数据。

   虽然荧光激活的流式细胞分选仪也可以进行单细胞蛋白质标记，但BD系统极大地扩大了人们可以在实验中使用的标记数量。Kulisch说：“这项技术与流式细胞术相比的优势在于，你可以做非常多的靶点。”他补充说，“我们已经在细胞内部同时标记了40个蛋白质，但合作伙伴甚至在同时做多达100个蛋白质。”流式细胞仪受限于它们可以追踪的荧光颜色的数量，通常每次只能追踪几种。

   对于没有细胞分选仪的实验室来说，条形码编码的抗体也更容易使用。Kulisch估计，完整的Rhapsody系统可以安装在实验台上，并在交付后几个小时内运行，而没有成像选项的系统“几乎就像凝胶切割平台一样容易安装”。与10X系统一样，Rhapsody的定价也符合各个实验室的预算，持续费用主要由测序花销来体现。

 

年轻人，要验证蛋白质水平

 

   通过检测蛋白质水平来验证单细胞RNA测序结果正在迅速成为标准做法。他说：“我们看到很多客户都在使用10X仪器，或者类似的仪器和方法，现在他们基本上都在进行下一步的蛋白质验证，这是审稿人和出版商要求的，“加州圣何塞ProteinSimple的营销总监Kelly Gardner说。

   Gardner销售的名为Milo的产品将蛋白质追踪发挥到了逻辑层面的极致：单细胞Western分子印迹，即使是最挑剔的第三方审稿人也会满意。该系统由一块上面有一层薄聚丙烯酰胺凝胶的玻璃片组成。超过6000个微孔中点有这种凝胶。与BD平台和其他平台类似，Milo使用泊松分布和受控加载来分发细胞。加德纳说：“很多孔都是空的，而有些孔只有一个细胞。”

   细胞一旦被放入，载玻片就会进入台式的Milo仪器，该仪器裂解细胞，对蛋白质进行凝胶电泳，然后在凝胶中使用一种专有的、紫外线激活的化合物来使蛋白质在原位发生交联。这消除了传统Western分子印记转膜步骤中固有的蛋白质损失，并达到了在单细胞中探测蛋白质所必需的灵敏度。之后，这一过程就像标准的蛋白质印迹一样继续进行，先是第一抗体，然后是荧光标记的第二抗体。最后，用微阵列扫描仪读取结果。

   Gardner说：“你最终得到了一个单细胞微阵列；我们有一个叫做Scout的软件包，它可以拍摄所有这些图像，检测峰值，并量化每个单细胞的峰值面积。”目前的系统不能同时提供来自同一细胞的RNA序列信息，但Gardner说，该公司正在努力做到这一点。

   同时，经过处理的Milo载玻片可以储存长达9个月，使研究人员能够分离样本，平行的进行RNA测序和单细胞蛋白印记，然后比较结果。Milo系统最常见的用途是服务于那些已经在进行单细胞RNA测序，并发现需要验证的转录本表达情况的研究人员。

   与其他设备制造商一样，ProteinSimple试图让有需要的研究人员能够接触到他们的产品。用户友好性也是一个主要的关注点，Gardner说，“我们甚至有非专业研究人员已经开始进行测试，在他们第一次接触仪器时就已经开始了。”

   无论他们使用何种方法，该领域的专家们一致认为，单细胞RNA分析正在推动一波巨大的探索浪潮。“似乎每周都有新的论文出现在高水平期刊上，他们有一个新颖的解决方案，提供了一个新的视角。”Hindson说。■

 

《科学新闻》 (科学新闻2021年2月刊 科学·生命)